在斑马鱼疾病模型中优化基因编辑技术CRISPR / Cas9的进展提供了以前用于研究人类遗传疾病的新的准确性和特异性水平。

影响全球所有年龄段人群的各种疾病，包括痴呆症，发育障碍，某些形式的癌症，肌肉营养不良和心脏病，都源于我们基因的突变。随着科学家们寻求了解这些疾病的遗传基础并努力开发有效的治疗方法，拥有疾病的遗传模型是他们研究的关键。虽然今天的许多研究都是在细胞系中进行的，但科学家们还需要了解基因如何在整个生物体水平上引起致病性。疾病的动物模型允许研究人员测试基因的功能，这些基因可能依赖于动物体内不同细胞类型之间的相互作用，或者可能影响胚胎生长时的健康发育。

小包装中的实验功率

虽然在实验室中考虑动物模型时通常会想到老鼠或果蝇，但由于许多重要原因，斑马鱼越来越受欢迎。由于它们的小尺寸和便宜的饲养，它们可以被大量饲养。它们的生命周期相对较短，在2-3个月内达到性成熟，每周可产生多达300个卵。胚胎在外部发育并且是透明的，使它们成为非侵入性微观研究的理想工具。斑马鱼胚胎也是药物筛选的优秀工具，因为它们具有大量的可用性，并且与它们生长的水有很大的接触面。

为了开发疾病的动物模型，科学家需要能够操纵动物的基因来复制导致疾病的遗传缺陷。在过去，方法依赖于整个基因的敲除或含有患者衍生突变的修饰基因的过表达，但这些方法在蛋白质表达水平或细胞类型特异性方面不完全地模拟人类疾病，并且还花费了大量时间即使在斑马鱼中也能发育。

基因编辑打开了新的大门

CRISPR / Cas9是基因编辑技术，目前正在革新分子生物学，包括疾病模型开发。该系统源自细菌免疫应答，其中来自诸如病毒的入侵者的DNA的短序列存储在细菌基因组中。如果细菌再次被感染，存储的病毒DNA序列有助于将蛋白质Cas9引导至病毒基因组中的匹配区域，其中Cas9导致DNA断裂导致根除入侵者。科学家们意识到，CRISPR / Cas9系统可以设计成将Cas9与指导分子一起传递到细胞中，以指导切割DNA的确切位点。新鲜受精的斑马鱼胚胎的即时可用性使它们非常适合CRISPR / Cas9基因编辑，因为胚胎可以在1细胞阶段用试剂显微注射，

推进'闯入'疾病模型

对于疾病建模至关重要，当切割后与单链模板进行DNA修复相结合时，CRISPR / Cas9使研究人员能够引入精确的点突变来复制那些在某些人类患者中引起疾病​​的突变。然而，尽管用CRISPR / Cas9对基因进行全面“敲除”现在相对简单，但在“敲入”模型中引入特定的点突变仍然存在问题，特别是在斑马鱼中，需要筛查许多动物才能找到窝藏的个体。期望的核苷酸变化。在疾病模型和机制中发表了三篇新文章探索使用CRISPR / Cas9开发人类疾病的敲入斑马鱼模型的潜力，并提出新的方法来克服在创建由特定点突变引起的人类疾病模型时仍然面临的问题。

“对于我们在斑马鱼或其他系统中设计什么来生成人类遗传疾病模型几乎没有任何限制.Dexor / Cas9首次真正可以测试人类疾病相关遗传变异在动物模型中的作用“西雅图儿童研究所和华盛顿大学的一篇文章的第一作者Lisa Maves博士说。人类基因组测序研究通常鉴定基因序列中的变体，即使这些变异的重要性不是立即明确的。Maves的研究团队专注于使用CRISPR / Cas9斑马鱼模型来测试先天性心脏缺陷患者中发现的基因变异是否有助于该疾病的发展。“

同时致力于改善目前对敲入模型创建的限制，首席研究员Andy Willaert博士及其在根特大学的研究小组一直在研究斑马鱼中具有CRISPR / Cas9和单链修复模板的点突变如何在斑马鱼基因组中引入错误。“斑马鱼和CRISPR / Cas9是大规模和快速疾病模型生成的理想组合，”Willaert说。“然而，使用单链修复模板的基因组编辑经常错误地发生，并且常用的分析技术并不总是检测到这种错误的修复。这可能导致模型具有基因破坏而不是敲入并且可能误解实验由于这些模型可能最终用于治疗应用，

在荷兰，来自Hubrecht研究所的Jeroen Bakkers博士和来自乌得勒支大学医学中心的Gijs van Haaften博士领导的研究小组正在研究CRISPR / Cas9技术开发人类疾病模型的患者特异性等位基因的潜力。科学家使用CRISPR / Cas9和一个简短的修复模板来生成由点突变引起的四种人类心血管疾病的敲入斑马鱼模型。文章的第一作者Federico Tessadori博士强调说，“引入点突变的能力恰好复制了人类患者的情况，对于正确理解疾病和成功开发治疗策略至关重要。”

尽管方法和重点不同，但贯穿所有三篇论文的共同信息是，斑马鱼具有创建由点突变引起的人类疾病的精确敲入模型的巨大潜力。然而，所有作者都强调筛选高效指导RNA和单链修复模板的重要性，并在过程完成后对错误进行全面测试。同样重要的是认识到最佳实验条件通常在疾病模型系统之间不同，并且当使用CRISPR / Cas9在斑马鱼或其他模式生物中开发敲入模型时，将始终需要某些优化步骤。

致力于为患者提供更好的治疗

展望未来，科学家们将继续改进CRISPR / Cas9技术，以开发无错误的敲入斑马鱼疾病模型。使用针对患者特异性突变的斑马鱼模型为化学筛选和新药开发提供了新的机会。最终，研究人员和照顾患者的临床医生之间的合作将更加了解人类遗传疾病，这将有助于家庭更好地了解孩子的病情或指导医生更好地接受治疗。