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平板划线分离法包括连续划线和分区划线。

平板划线分离法：在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。

常用的平板划线分离法有以下两种：

(1)连续划线分离法：此法主要用于杂菌不多的标本。用接种环取标本少许，于平板1/5处密集涂布，然后来回作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。

(2)分区划线分离法：本法适用于杂菌量较多的标本。先将标本均匀涂布于平板表面边缘一小区(第一区)内，约占平板1/5面积，再在二、三、……区依次连续划线。每划完一个区，均将接种环灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线2～3次，使菌量逐渐减少，以获得单个菌落。