Stowers医学研究所的研究人员已经微调了一种方法，可以查明大型多蛋白复合物中彼此接近并可能直接相互作用的表面。

在2020年4月14日在线发表的《细胞报告》中，Washburn实验室的成员描述了三种方法的结合：亲和标签蛋白纯化，高分辨率的化学交联和蛋白对接的计算分子建模以捕获有关Sin3 / HDAC蛋白复合物中相邻表面的信息。

Stowers蛋白质组学中心主任Michael Washburn博士解释说：“将所有这些部分放在一起，可以为我们提供蛋白质复合物如何组合的新视角，并有可能更快地提供更多信息。

Washburn说：“这些功能已经存在，并且已经一起使用过，但是还没有大量使用。”“它确实是对现有技术(例如核磁共振(NMR)，低温电子显微镜(EM)和X射线晶体学)的补充，以真正了解蛋白质复合物的组装方式，并了解它们是如何相互作用的?发生了什么?当您用药物或突变干扰他们时?”

Sin3 / HDAC复合物通过将组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)带入基因组中的特定位置并从组蛋白尾巴上去除乙酰基，从而抑制基因转录，从而在染色质重塑和人类癌症生物学中发挥作用。尽管已经很好地定义了Sin3 / HDAC复合物的成分，但是使用任何一种技术都很难实现大型多蛋白复合物的高分辨率描述。

Washburn实验室的研究专家，论文的第一作者，查尔斯·班克斯(Charles Banks)博士说，仅质谱法存在的问题，“我们只能鉴定试管中的蛋白质。对哪些蛋白质与哪些其他蛋白质发生物理相互作用一无所知。”

Banks解释说，虽然可以完成单个蛋白质相互作用的测定，但通常需要大量时间。“真正的好处是，在分离蛋白质之前，我们可以捕获有关完整复合物的某种结构信息，这就是交联的来源。”

这项研究中使用的交联剂二琥珀酰亚胺基亚砜(DSSO)可以使蛋白质复合物中的氨基酸(特别是赖氨酸残基)相互交联，彼此之间的距离约为30埃。而且，沃什伯恩说，它“在新型质谱仪中做了非常聪明的事情” —可以裂解，本质上提供了交联肽的指纹。

班克斯解释说：“如果我看到两个赖氨酸残基之间发生交联，则意味着在完全折叠的蛋白质中，这些赖氨酸非常靠近，从而提供了位置信息。”“而且，如果我有两种不同的蛋白质，以及两种赖氨酸残基(一种蛋白质中的一种)交联在一起，这意味着这两种蛋白质中的赖氨酸通常非常紧密地结合在一起，这与蛋白质之间的相互作用是一致的。”

班克斯说，然后，他们能够使用蛋白质间的交联信息来尝试将现有的晶体结构对接在一起，类似于组装3D拼图。

在这项研究中，由班克斯(Banks)和共同第一作者，蛋白质组学中心科学家张颖(Ying Zhang)博士领导，Stowers研究人员使用HaloTag亲和纯化和SAP30L亚基作为诱饵从HEK293T细胞中分离了Sin3 / HDAC复合物。化学交联后，他们发现了13个Sin3亚基的66个蛋白间交联键和63个自交联键，其中他们能够使用分子模型确定5个亚基(SAP30L，HDAC1，SUDS3，HDAC2和ING1)的相对位置。 )围绕Sin3A支架。

班克斯解释说：“我们认为Sin3A是所有其他亚基组装的平台。”“我们仍然不确定哪些亚基可以同时与Sin3A结合，尽管我们知道其中某些亚基肯定不会同时结合。”

“但是为什么除了HDAC之外还有其他所有这些子单位?为什么不招募HDAC呢?”他问。“我们认为，Sin3复合物可能控制特定基因组的转录，可能在特定时间和地点在特定细胞中，我们认为其他亚基可能在控制这种特异性。”

当被问及未来的研究方向时，班克斯回答说：“目前我们的交联剂有些局限，因为它只能基于两个彼此靠近的赖氨酸来捕获信息。拥有不同的交联剂真的很好可能会在其他氨基酸之间发生交联，特别是如果我想研究另一种最喜欢的蛋白质时，它的序列中就没有很多赖氨酸。”

Washburn说，具有交联信息的分子建模“就像为获得非常大的复合物的完整结构奠定了基础，这很难做到”。

“将来，我们可以想象到我们到目前为止所做的一切，并尝试在这些组件上进行cryo-EM，并观察这两个数据集如何互补。Cryo-EM是一项了不起的技术，并将其与交联相结合质谱可以使这些分子在实际界面上看起来更清晰。” Washburn解释说。

“这是技术的融合，使我们能够在几乎任何情况下在几乎任何蛋白质复合物上做到这一点”，甚至可以，以了解冠状病毒蛋白质如何与人类蛋白质复合物相互作用。

“您只需要能够纯化它。如果您可以获得足够的材料，您就可以真正研究任何蛋白质复合物。这是进行良好的生物化学和制备好的样品的问题。如果您可以获取非常壮观的数据，则可以构建像这样的模型”，Washburn继续说道。

他说：“很长时间以来，我对新功能并不感到兴奋。”

这项工作的其他合著者包括Sayem Miah博士，Yan Hao，Mark K.Adams博士，Whihui Wen，Janet L.Thornton和Laurence Florens博士。

这项工作由Stowers医学研究所和国立卫生研究院的国立普通医学科学研究所资助(向MPW授予RO1GM112639，向MKA授予F32GM122215)。内容仅由作者承担，并不一定代表美国国立卫生研究院的正式观点。

放置调查结果摘要

Sin3 / HDAC是一种大型的多蛋白复合物，通常负责“关闭”一组特定的基因。当其主要支架发生突变时，该复合物也与癌症生物学有关，并且靶向治疗多种人类癌症，包括三阴性乳腺癌和胰腺癌。尽管已经对Sin3 / HDAC进行了充分的研究，并且已经确定了其组成亚基，但是很难清楚地了解亚基的组装方式。

Stowers医学研究所的Michael Washburn博士及其实验室长期以来一直使用蛋白质组学和蛋白质质谱技术研究蛋白质网络中的复合物。在过去的几年中，多项技术得到了改进，并且结合起来使用，可使研究人员获得有关多蛋白复合物中相邻表面空间排列的明确信息。

Washburn实验室的一份报告于2020年4月14日在线发表在《Cell Reports》中，描述了三种现有方法的使用-亲和标签蛋白纯化，高分辨率质谱法的化学交联以及具有蛋白质对接的计算分子模型-以精确定位特异性完整蛋白质复合物中的表面彼此非常接近。他们总共为13个Sin3 / HDAC亚基鉴定了66个蛋白间交联键(两个不同蛋白之间)和63个自交联键(同一蛋白内)，其中一些互斥。

这些方法的组合在过去曾被偶尔使用，但随着技术的发展，组合技术将有可能被更多地使用，从而使研究人员能够精确查明从任何来源获得的任何蛋白质复合物中的相互作用表面。这些功能可以进一步与其他功能强大的技术(例如冷冻电子显微镜)结合使用，以提供更完整的蛋白质复合物内界面处相互作用的更高分辨率的图像。