乳酸脱氢酶催化乳酸至丙酮酸之间的可逆性反应，目前正反两个方向的反应均能测定，由于逆反应的速度比正反应快4倍，测得的活性也高得多，因此采用不同反应方式的试剂盒得出的结果也不相同。

1994年IFCC推荐的参考方法为从乳酸至丙酮的正反应。

L-乳酸+氧化型辅酶Ⅰ→丙酮酸+还原型辅酶Ⅰ。