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Nat Commun:北大陈鹏与王初研究组共同开发新一代基因编码光交联探针

摘要 : 2016年7月27日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Communications》杂志在线发表了北京大学化学与分子工程学院陈鹏研究组与王初研究组合作题为“Genetically encoded protein photocrosslinker with a transferable mass spectrometry-identifiable label”的研究论文

 2016年7月27日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Communications》杂志在线发表了北京大学化学与分子工程学院陈鹏研究组与王初研究组合作题为“Genetically encoded protein photocrosslinker with a transferable mass spectrometry-identifiable label”的研究论文,论文报道了一种基因编码并具有“质谱标签”转移功能的光交联探针DiZHSeC。基于该探针,作者开发了一种用于鉴定活细胞內蛋白-蛋白相互作用的新技术—IMAPP (In-situ cleavage and MS-label transfer After Protein Photocrosslinking)。该技术在实现高置信度底物蛋白鉴定的同时,还能对蛋白-蛋白相互作用的界面进行绘制。陈鹏研究组的11级博士生杨熠为本文的第一作者。陈鹏和王初为本文的共同通讯作者。

蛋白-蛋白相互作用是支撑生命活动的重要基础,其相互作用网络十分复杂,在活体条件下开展研究极具挑战性。近年来,光交联技术,尤其是位点特异性的光交联探针与质谱技术的联用,已经成为活细胞內研究蛋白-蛋白相互作用的有力工具。该技术通过基因编码非天然氨基酸将光活性基团定点引入蛋白质相互作用界面处的特定位点,并利用紫外光照射激活并捕捉“诱饵”蛋白。陈鹏研究组曾于2011年开发了第一代光交联探针DiZPK,并用其鉴定了极酸环境下大肠杆菌抗酸伴侣蛋白HdeA的“客户”蛋白(Nat. Chem. Biol, 2011, 7, 671)。然而,第一代光交联探针的下游处理步骤采用了传统的“亲和”纯化方法,从而不可避免的引入非特异性吸附蛋白和非直接相互作用的蛋白。另一方面,利用DiZPK获得的交联肽段难以通过传统的质谱分析方法进行解析,从而丢失了蛋白质相互作用的界面信息。在接下来的研究中,陈鹏研究组于2014年开发了第二代,可切割的光交联探针DiZSeK (J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 11860)。该探针可以在交联后实现底物蛋白与诱饵蛋白的分离,在一定程度上降低了鉴定背景。但该探针仍无法解决交联肽段和交联位点的鉴定问题。

在本研究中,陈鹏与王初两个研究组合作开发了一种具有“质谱标签”转移功能的第三代光交联探针DiZHSeC。该探针不仅可以实现交联后底物蛋白与诱饵蛋白的分离,还能同时在底物蛋白上原位产生一个特异的“质谱标签”。通过该“质谱标签”,研究者们可以很容易地在质谱结果中区分底物与非特异性吸附以及非直接相互作用的多肽片段。此外,通过“质谱标签”,研究者们可以使用常规的质谱分析软件对交联位点进行鉴定,从而获得蛋白质相互作用界面的信息。他们利用基于DiZHSeC设计的IMAPP技术对HdeA的“客户”蛋白进行了进一步鉴定,鉴定的假阳性率从原先的50%降低到了4%。紧接着,他们还利用IMAPP技术对 HdeA二聚化界面,以及HdeA与HdeA的“客户”蛋白- DegP的相互作用界面进行了绘制。最后,他们还将该技术拓展至哺乳动物细胞中,研究了小G蛋白RhoA与其支架蛋白RTKN的相互作用,鉴定了二者的作用界面。通过上述的应用展示,作者期望IMAPP技术可以被广泛应用于捕捉蛋白质相互作用网络以及绘制蛋白质相互作用界面。这一策略尤其适用于那些利用传统结构分析方法难以获得的相互作用界面,如固有或者条件无序蛋白,以及膜蛋白相互作用的界面。

利用IMAPP技术鉴定活细胞内的蛋白-蛋白相互作用

原文链接:

Genetically encoded protein photocrosslinker with a transferable mass spectrometry-identifiable label

原文摘要:

Coupling photocrosslinking reagents with mass spectrometry has become a powerful tool for studying protein–protein interactions in living systems, but it still suffers from high rates of false-positive identifications as well as the lack of information on interaction interface due to the challenges in deciphering crosslinking peptides. Here we develop a genetically encoded photo-affinity unnatural amino acid that introduces a mass spectrometry-identifiable label (MS-label) to the captured prey proteins after photocrosslinking and prey–bait separation. This strategy, termed IMAPP (In-situ cleavage and MS-label transfer After Protein Photocrosslinking), enables direct identification of photo-captured substrate peptides that are difficult to uncover by conventional genetically encoded photocrosslinkers. Taking advantage of the MS-label, the IMAPP strategy significantly enhances the confidence for identifying protein–protein interactions and enables simultaneous mapping of the binding interface under living conditions.

来源: Nature Communications 浏览次数:0

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