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Science Reports:检测CRISPR/Cas9脱靶效应的简单方法

摘要 : CRISPR/Cas系统目前被广泛应用于各种研究中,而将来更有望用于临床,但脱靶效应的存在始终是个问题。七月二十四日,来自意大利的研究人员,提出了一种基于荧光原位杂交(FISH)的简单策略,可让我们对一个给定质粒的非特异性整合进行检测和频率评估,相关研究结果发表在Nature旗下子刊《Scientific Reports》。

 CRISPR/Cas系统目前被广泛应用于各种研究中,而将来更有望用于临床,但脱靶效应的存在始终是个问题。七月二十四日,来自意大利国家研究委员会(Consiglio Nazionale delle Ricerche)和意大利人类临床和研究中心的研究人员,提出了一种基于荧光原位杂交(FISH)的简单策略,可让我们对一个给定质粒的非特异性整合进行检测和频率评估,相关研究结果发表在Nature旗下子刊《Scientific Reports》。

CRISPR/Cas9系统是一种创新、特异而有效的基因编辑方法。然而,它应用于人类研究,还需要进一步调查其他基因位点的额外修饰(所谓的“脱靶”事件)。目前,科学家们已经使用了几种方法,来尽量减少脱靶事件的程度,并验证脱靶的非特异性切割。

当前,检测打靶和脱靶事件的程序包括,使用能够识别双链DNA不匹配的核酸酶来分析细胞库(DNA体外裂解实验),通常是在一个癌细胞株中进行的。如果选择的单导向RNA(sgRNA)在这个分析中正常运行,这个程序就能在所需的细胞上重复,并且通过相关区域的扩增和测序,鉴定靶向的同基因克隆。这些步骤可让我们识别具有预期修饰的克隆。然而,这样更难以排除脱靶事件:为此,研究人员通过软件扫描整个基因组,寻找序列的相似性,分析假定的脱靶效应,并对假定的位点进行扩增和测序。

即使在这种情况下,通过软件工具仍不能确定脱靶效应,除非对双亲和修饰克隆进行全基因组测序(WGS)。最近发表的两篇论文,报道了在靶向多能干细胞克隆中进行全基因组测序所获得的结果,表现出较低频率的脱靶事件。然而,这种方法是昂贵和耗时的。因此,迫切需要一种程序,能够快速识别打靶和脱靶效应的相对频率,从而有助于初始阶段的分析,可让我们消除打靶/脱靶事件比率较低的候选克隆。

这项研究表明,荧光原位杂交(FISH)——广泛用于诊断和基因组研究的一种细胞遗传学技术,是检测CRISPR/Cas9基因编辑结果的很好工具。该方法可以应用于基因编辑分析的初始步骤,可以直接在靶细胞系上进行。FISH分析表明,一个给定质粒的非特异性整合与软件预测的脱靶位点不匹配。研究人员推断,这些CRISPR介导的脱靶DNA切割的频率是可以忽略不计的,因为,由于自发性双链断裂的出现,研究人员观察到了更多的非特异性质粒整合。

作者认为,这种分析代表了一种很有前途的方法,可对候选RNA导向行为获得快速的评估,能评估脱靶事件,并鉴定在选择位点之外有额外插入的克隆,包括通过序列相似性预测不到的脱靶事件。作者建议,在候选sgRNA引导的初步评估中使用这种细胞遗传学方法,将会减少晚期寻找最佳基因组序列所付出的时间和精力。

原文标题:A pre-screening FISH-based method to detect CRISPR/Cas9 off-targets in mouse embryonic stem cells

原文摘要:Abstract: The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/associated 9 (Cas9) technology has been recently added to the tools allowing efficient and easy DNA targeting, representing a very promising approach to gene engineering. Using the CRISPR/Cas9 system we have driven the integration of exogenous DNA sequences to the X-linked Hprt gene of mouse embryonic stem cells. We show here that a simple fluorescence in situ hybridization (FISH)-based strategy allows the detection and the frequency evaluation of non-specific integrations of a given plasmid. FISH analysis revealed that these integrations do not match the software predicted off-target loci. We conclude that the frequency of these CRISPR-mediated off-target DNA cuts is negligible, since, due to the occurrence of spontaneous double-strand breaks, we observed more aspecific plasmid integrations than those corresponding to predicted off-target sites.

来源: Science Reports 浏览次数:0

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