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Nat Commu:日本京都大学的研究团队发现用CRISPR构建转基因动物的简单方法

摘要 : 1月20日的Nature Communications杂志上日本京都大学的研究团队发表文章,展示了一种在受精卵中实现CRISPR大片段敲入的简单策略。文章的通讯作者是日本京都大学的Tomoji Mashimo。

1月20日的Nature Communications杂志上日本京都大学的研究团队发表文章,展示了一种在受精卵中实现CRISPR大片段敲入的简单策略。文章的通讯作者是日本京都大学的Tomoji Mashimo。

CRISPR-Cas是一种强大的基因组编辑工具,注射到受精卵之后可以生成相应的转基因动物。不过,用CRISPR在受精卵中靶向敲入(KI)大片段并不容易。

转基因动物(GM)在基因功能和人类疾病研究中起到了重要的作用。CRISPR-Cas是一种强大的基因组编辑工具,注射到受精卵之后可以生成相应的转基因动物。不过,用CRISPR在受精卵中靶向敲入(KI)大片段并不容易。

研究人员将CRISPR-Cas与单链寡聚脱氧核苷酸(ssODN)结合起来,在大鼠基因组中进行了有效的基因敲入。他们把引导RNA(gRNA)、Cas9信使RNA和长ssODN注射到大鼠受精卵,在基因组的Thy1位点实现了GFP敲入。研究人员还使用两个gRNA和两个短ssODN,通过ssODN介导的末端接合(end joining)敲入质粒DNA,包括200 kb的BAC。研究指出,ssODN介导的CRISPR敲入适用于任何靶位点和载体,而且非常简便不需要构建同源臂。

转基因猪在农牧业和生物医学领域有着举足轻重的作用,可以为人类提供更高质量的食物,也能作为动物模型帮助人们理解和治疗疾病。然而,生成转基因猪是一个漫长而低效的过程,这大大阻碍了转基因猪模型的实际应用。2015年9月,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的李奎教授领导研究团队发表了一项突破性成果。他们首次结合CRISPR/Cas9与体细胞核移植技术获得了位点特异性的基因敲入猪模型。

著名遗传学家George Church正在追求一种新转基因技术,gene drive。这种技术能把外源基因快速引入动物群体,并由此消除相关疾病,或者对害虫和入侵物种进行控制。然而,有不少人担心gene drive会给生态系统带来难以估量的危害。为了阐明以CRISPR为基础的gene drive技术,回应公众对这一技术的担忧,2014年08月Church、Esvelt等人在eLife和Science杂志上接连发表了两篇文章。文章介绍了gene drive的应用潜力,可能的环境影响以及相应的风险管理。

尽管转基因生物的风险有被夸大之嫌,但转基因逃逸的确可能扰乱生态系统,因此科学家们一直致力于打造牢靠的生物防线。George Church的研究团队在2015年1月的Nature杂志上发表文章,向人们展示了解决这个问题的新方案。他们对E. coli菌株进行遗传学改造,将一种人工合成的氨基酸整合到基因组的多个位点。缺乏这种氨基酸,细菌就不能将RNA翻译成正确折叠的蛋白。这种人造氨基酸不存在于自然界中,E. coli本身也无法合成它,只能从特殊的人工培养基中获得。

原文链接:ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes

原文摘要:The CRISPR-Cas system is a powerful tool for generating genetically modified animals; however, targeted knock-in (KI) via homologous recombination remains difficult in zygotes. Here we show efficient gene KI in rats by combining CRISPR-Cas with single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs). First, a 1-kb ssODN co-injected with guide RNA (gRNA) and Cas9 messenger RNA produce GFP-KI at the rat Thy1 locus. Then, two gRNAs with two 80-bp ssODNs direct efficient integration of a 5.5-kb CAG-GFP vector into the Rosa26 locus via ssODN-mediated end joining. This protocol also achieves KI of a 200-kb BAC containing the human SIRPA locus, concomitantly knocking out the rat Sirpa gene. Finally, three gRNAs and two ssODNs replac 58-kb of the rat Cyp2d cluster with a 6.2-kb human CYP2D6 gene. These ssODN-mediated KI protocols can be applied to any target site with any donor vector without the need to construct homology arms, thus simplifying genome engineering in living organisms.

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