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Nature Methods:在修饰小鼠里脱靶突变是罕见的

摘要 : 近日,黄行许教授研究小组与Wellcome Trust Sanger研究所的William C Skarnes展开合作,调查了Cas9基因改良小鼠的脱靶突变情况。研究结果发布在5月28日的《自然方法》(Nature Methods)杂志上。

 南京大学模式动物研究所的黄行许(Xingxu Huang)教授,是近年来基因组编辑领域的风云人物之一。其实验室不仅首次在世界上利用CRISPR-Cas9进行了大鼠的条件性基因敲除,还通过原核注射实现了世界上首次猴基因敲除。这些成果在国际上受到广泛的瞩目。

近日,黄行许教授研究小组与Wellcome Trust Sanger研究所的William C Skarnes展开合作,调查了Cas9基因改良小鼠的脱靶突变情况。研究结果发布在5月28日的《自然方法》(Nature Methods)杂志上。

CRISPR-Cas9系统是一个可用于实现小鼠受精卵基因组编辑的高度有效的技术。在以往的研究中,黄行许教授研究小组与Skarnes证实,将Cas9 mRNA和两个单导向RNA(sgRNAs)通过原核注射的方法注入到小鼠胚胎,在Cas9诱导出X连锁Ar基因突变的同时也引起了一个脱靶突变。随后他们采用注射Cas9切口酶(nickase)和一对sgRNAs成功消除了这一脱靶效应,证实了利用切口酶可以提高CRISPR-Cas9的特异性。

在这篇最新的Nature Methods文章中,作者们报告称利用全基因组测序更全面地评估了注入Cas9与Cas9切口酶诱导的损害。他们首先采用Cas9和Cas9 D10A切口酶诱导出了Ar双等位基因缺失的小鼠(C57BL/6J × CBA), 然后让两种雌性小鼠与C57BL/6J雄鼠交配,对生成的杂合子Ar突变小鼠后代进行了测序。为了控制品种特异性的变异,他们还测序了一只C57BL/6J小鼠和CBA小鼠。然后以20–25×的深度进行全基因组测序检测了95%以上的杂合变异。

研究人员运用两种标准的计算方法检测了小的插入和缺失(indels)——这是核酸内切酶诱导损伤的标志。他们很容易地便检测到Ar突变等位基因传递给了每个F1后代。在8,441个可能的脱靶位点中,他们只找到了一个真正的脱靶位点OTS3。通过一些过滤步骤,他们将indels的数量减少到一组120个高质量的变异。进一步的调查结果表明这120个变异似乎没有一个是真正的脱靶位点。由此作者们提出这些突变是自发产生,而非Cas9不受约束的核酸酶活性所导致。

近期的三项研究报道显示,Cas9工程改造人类诱导多能干细胞中只有极少的全基因组损伤,新研究结果与此完全相一致,证实了在受精卵中Cas9核酸内切酶诱导的非目的突变是稀少的。

原文标题:Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice

原文摘要:The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system is a highly efficient technology for genome editing of mouse zygotes1. Previously, we reported cotransmission of a Cas9-induced mutation in the X-linked Ar gene and an off-target mutation to offspring of founder animals from pronuclear injection of Cas9 mRNA and two single guide RNAs (sgRNAs)2. No off-target damage is observed in offspring derived from founder animals injected with Cas9 nickase mRNA and a pair of sgRNAs, showing that CRISPR-Cas specificity is improved by employing nickases2, 3. Here, we used whole-genome sequencing to more thoroughly assess any damage induced by injection of Cas9 versus Cas9 nickase.

来源: Nature Methods 浏览次数:0

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