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Nature:多重同源定向修复对基因组区域进行饱和编辑

摘要 : 美国华盛顿大学的研究人员将CRISPR/Cas9 RNA引导的切割与多路同源性修复结合在一起,对一些基因组区域成功进行了饱和编辑。研究表明,采用这种巧妙的方法来检测大量突变的功能性影响,将有可能推动对一些顺式调控元件和反式作用因子进行高分辨率的功能解析,并大大提高我们解读临床测序中不确定意义的一些变异的能力。相关文章发表于2014年8月20日的《Nature》杂志上。
六聚体的分布和两两相关性的丰度

六聚体的分布和两两相关性的丰度

想要了解我们的基因,这真的是一个艰巨的工作。人类DNA的长度大约为65亿个碱基对。任两个人大约每1000个碱基对就存在一个DNA差异。尽管一些差异具有很大的影响,大多数则主要是产生微小的效应或是根本不造成影响。凭借当前的技术可以快速且廉价地读取DNA,但了解每种改变的含义却要难得多。

这看似是一个很容易解决的问题。揭示基因中的一些变异是否重要,是否改变了基因,并看看发生了什么。然而,事实证明这极具挑战,我们的细胞进化了一些机制来保护自身的DNA阻止发生所需要的改变。基因编辑是一种解决方法。最初,科学家们利用一种叫做锌指核酸酶的工程酶来达到这一目的。近期,又新添了另外的两种工具——TALENs和CRISPR相关酶。然而,一直以来基因编辑主要都是被应用于将单一的改变导入到一个或几个基因组位点,而未曾尝试过在单一的基因组位点导入多个设计的改变。

在这篇文章中,研究人员利用一个供体模板复合文库,将CRISPR/Cas9 RNA引导的切割与多路同源性修复结合到一起,对一些基因组区域成功进行了饱和编辑。在BRCA1基因的第18个外显子中,他们用所有可能的六联体(hexamer)DNA片段替代了一个包含6个碱基对的基因组区域,并用所有可能的单核苷酸变异(SNVs)来替代了整个外显子,结合深度测序检测了对于转录物丰度的强力影响。此外,他们还用相同的方法对细胞生存至关重要的基因:DBR1的一个保守编码区域进行了饱和基因组编辑,检测了对于生长的相对影响。

研究人员表示结合饱和基因编辑和深度测序,采用这种巧妙的方法来检测大量突变的功能性影响,将有可能推动对一些顺式调控元件和反式作用因子进行高分辨率的功能解析,并大大提高我们解读临床测序中不确定意义的一些变异的能力。

原文摘要:

Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair

Gregory M. Findlay, Evan A. Boyle, Ronald J. Hause, Jason C. Klein & Jay Shendure

Saturation mutagenesis—coupled to an appropriate biological assay—represents a fundamental means of achieving a high-resolution understanding of regulatory and protein-coding nucleic acid sequences of interest. However, mutagenized sequences introduced in trans on episomes or via random or “safe-harbour” integration fail to capture the native context of the endogenous chromosomal locus. This shortcoming markedly limits the interpretability of the resulting measurements of mutational impact. Here, we couple CRISPR/Cas9 RNA-guided cleavage with multiplex homology-directed repair using a complex library of donor templates to demonstrate saturation editing of genomic regions. In exon 18 of BRCA1, we replac a six-base-pair (bp) genomic region with all possible hexamers, or the full exon with all possible single nucleotide variants (SNVs), and measure strong effects on transcript abundance attributable to nonsense-mediated decay and exonic splicing elements. We similarly perform saturation genome editing of a well-conserved coding region of an essential gene, DBR1, and measure relative effects on growth that correlate with functional impact. Measurement of the functional consequences of large numbers of mutations with saturation genome editing will potentially facilitate high-resolution functional dissection of both cis-regulatory elements and trans-acting factors, as well as the interpretation of variants of uncertain significance observed in clinical sequencing.

来源: Nature 浏览次数:168

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