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Nat Biotechnol:CRISPR基因组编辑新工具

摘要 : 2016年6月6日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下生物技术领域子刊《Nature biotechnology》杂志上在线发表了韩国基础科学研究院Jin-Soo Kim研究员的两篇研究论文

2016年6月6日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下生物技术领域子刊《Nature biotechnology》杂志上在线发表了韩国基础科学研究院Jin-Soo Kim研究员的两篇研究论文,证实了Cpf1作为一种不会引发意外突变的精确基因组编辑工具具有的优势。KIM Daesik和Junho K Hur分别为论文的第一作者,Jin-Soo Kim为论文通讯作者。

研究人员证实了Cpf1作为一种高度特异的可编程工具适用于精确的基因组编辑,并称利用CRISPR-Cpf1构建出了突变小鼠。研究人员利用了Cpf1家族蛋白中最有效的两种蛋白AsCpf1和LbCpf,并完成了Digenome-seq测试:他们设计出这种方法来鉴别研究人员希望Cpf1在整个基因组中进行切割的目的(在靶)及意外(脱靶)位点。采用预装配的重组Cpf1 RNPs切割从人类细胞中分离出的无细胞基因组DNA,然后进行全基因组测序。比对序列读取,计算鉴别出了对应的打靶和脱靶体外切割位点。

全基因组分析结果显示Cpf1高度特异,相比Cas9显示较少的脱靶切割位点(LbCpf1为6个,AsCpf1为12个),切割了人类基因组中>90个位点。具体说来,在大多数体外切割位点,代表脱靶效应的插入缺失(indels)频率低于0.1%,远低于在靶位点的插入缺失频率,表明两种Cpf1蛋白几乎没有脱靶效应。“值得注意地是,靶向某一位点的LbCpf1和AsCpf1只切割了整个人类基因组中的一个在靶位点,”KIM Daesik说。

为了减少脱靶效应,我们将预装配Cpf1 RNPs引入细胞中,假定与Cas9 RNPs相似,Cpf1 RNPs将会在转染后立即切割靶位点,并很快被内源性酶快速降解,由此在不牺牲在靶效应的情况下减少了脱靶效应,”KIM Jin-Soo说。的确,Cpf1 RNPs没有诱导足够高到在脱靶位点生成突变的插入缺失。

为了证实Cpf1显著的特异性,来自IBS中心的另一个研究小组成功将Cpf1 RNP介导的突变带到了小鼠胚胎中。研究人员靶向了Foxn1(调控免疫系统,包括皮肤毛发生长的一个转录因子)和Tyrosinase(催化生成黑色素的一种酶)。

HUR K Junho说:“数据显示Cpf1 RNP传送到小鼠胚胎中导致分别以64%和33%的高突变率敲除了目的遗传功能。我们将突变小鼠胚胎移植到代孕母鼠体内,获得了具有定向突变的小鼠。这些突变分别导致了小鼠无发及白发。为了调查Cpf1是否具有脱靶效应,我们利用分离自Foxn1突变小鼠和野生型同胞的基因组DNA进行了全基因组测序。序列分析结果显示没有发生脱靶突变。对其他突变的靶向深度测序也显示没有脱靶突变。”

 

在这项研究中,研究人员利用了电脉冲让Cpf1 RNPs同时进入到50个小鼠胚胎中。这种新电穿孔方法传送了生成突变动物需要的基因组编辑分子。添加Cpf1进入它的工具箱,CRISPR编辑技术可以构建出更加多样的小鼠模型。KIM Jin-soo说:“由于两项研究证实了Cpf1优越的特异性,这一新核酸酶将更广泛的用于精确基因组编辑,而不会产生意外突变。从诸如无毒抗癌药物等治疗方法、干细胞治疗到高附加值的牲畜和农产品,CRISPR Cpf1的应用将不受限制而保持开放。”

原文链接:

Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells;doi:10.1038/nbt.3609

Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.;doi:10.1038/nbt.3596

来源: Nature biotechnology 浏览次数:4

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