nature

当前位置: Nature » 生物技术 » 正文

Nat Biotechnol:美科学家成功提高CRISPR基因编辑成功率

摘要 : 2016年1月21日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Biotechnology》杂志上在线发表加州大学伯克利分校创新基因组学研究所Jacob E Corn研究员对CRISPR-Cas9技术做出重大改进,在用一段短DNA片段替代另一段DNA时获得了高达60%的前所未有的成功率

 2016年1月21日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Biotechnology》杂志上在线发表加州大学伯克利分校创新基因组学研究所Jacob E Corn研究员对CRISPR-Cas9技术做出重大改进,在用一段短DNA片段替代另一段DNA时获得了高达60%的前所未有的成功率。

这一改进的技术在试图去修复导致遗传性疾病,如镰状细胞病或严重联合免疫缺陷的遗传突变之时尤其有用。它使得研究人员能够用正常的序列来修补异常的DNA片段,并有潜力修复这一缺陷,其已在细胞培养物中发挥作用促进了修复缺陷基因。

Jacob Corn说:“CRISPR-Cas9令人兴奋的地方在于它有希望在我们基因组中适当的地方修复基因,但效率可能很低。如果你将基因编辑视作是一台文字处理机,我们知道如何了剪切,但我们需要一种更有效的方法在我们进行剪切的位点粘贴胶合一段新的DNA片段。”

短DNA片段出现问题,包括单碱基突变,是许多遗传疾病的典型特点。“在你想改变一些长度为30bp的极小DNA区域的情况下,这一技术将会是非常有效的”博士后Christopher Richardson说。

Richardson发现Cas9在完成了对双链DNA切割的很长时间后——长达6小时内仍然附着在染色体上,据此开发出了这一新方法。Richardson仔细观察了结合两条DNA链的Cas9蛋白,发现这一蛋白紧紧抓住了三个切口端,而有一个切口端不受牵制。

当Cas9切割DNA时,细胞中的修复系统会抓住一段互补DNA片段,作为模板来修复切口。研究人员可以添加一些模板——这些模板对基因组中的现有序列做了一些改变,例如纠正了致病突变。

Richardson推测,将这一替代模板直接带到切割位点,将会提高修复效率。他构建出了一个DNA片段,其与自由的DNA端相匹配,并携带着将插入到另一端中去的遗传序列。这一技术能够极好地发挥作用,使得突变的修复成功率达到了60%。

Richardson说:“我们的数据表明,在分子水平上Cas9造成的断裂与其他靶向核酸酶如TALENS和锌指核酸酶生成的断裂可能是不同的,这意味着我们正在采用的策略可以让你更有效地修复Cas9造成的断裂。”

研究人员还证实,一些结合但不切割DNA的Cas9蛋白变异体也可以在结合位点成功地粘贴一段新DNA序列,其有可能通过在靶DNA上形成一种“泡状”结构来发挥作用吸引了修复模板。Corn说,利用不切割基因组的Cas9来进行基因编辑,消除了在基因组中发生脱靶切割的危险,有可能比标准的基因编辑更安全。

原文链接:

Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA

原文摘要:

Targeted genomic manipulation by Cas9 can efficiently generate knockout cells and organisms via error-prone nonhomologous end joining (NHEJ), but the efficiency of precise sequence replacement by homology-directed repair (HDR) is substantially lower1, 2. Here we investigate the interaction of Cas9 with target DNA and use our findings to improve HDR efficiency. We show that dissociation of Cas9 from double-stranded DNA (dsDNA) substrates is slow (lifetime ~6 h) but that, before complete dissociation, Cas9 asymmetrically releases the 3′ end of the cleaved DNA strand that is not complementary to the sgRNA (nontarget strand). By rationally designing single-stranded DNA (ssDNA) donors of the optimal length complementary to the strand that is released first, we increase the rate of HDR in human cells when using Cas9 or nickase variants to up to 60%. We also demonstrate HDR rates of up to 0.7% using a catalytically inactive Cas9 mutant (dCas9), which binds DNA without cleaving it.

来源: Nature Biotechnology 浏览次数:0

热门文章TOP

RSS订阅 - 填写您的邮件地址,订阅我们的精彩内容: - 网站地图
网站联系电话:020-87540820 备案号:粤ICP备11050685号-8 增值电信业务经营许可证:粤B2-20120479
©2011-2015 生物帮 All rights reserved.