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Nature子刊:蛋白质绝对定量的新方法

摘要 : 生物学研究离不开定量。对于绝对定量,通常需要利用已知浓度的分子绘制标准曲线。最近,麻省理工学院、梅约诊所和赛默飞世尔科技的研究人员在《Nature Communications》杂志上介绍了一种新方法,能利用串联质谱仪对多个蛋白质进行绝对定量。

生物学研究离不开定量。对于绝对定量,通常需要利用已知浓度的分子绘制标准曲线。最近,麻省理工学院、梅约诊所和赛默飞世尔科技的研究人员在《Nature Communications》杂志上介绍了一种新方法,能利用串联质谱仪对多个蛋白质进行绝对定量。

这种方法称为MARQUIS(Multiplex Absolute Regressed Quantification with Internal Standards),依靠两种现成的技术:重同位素标记的合成肽段以及质谱的同位素标记试剂。iTRAQ和TMT等试剂有着相同的分子量,但在质谱仪内产生特征的片段。

在MARQUIS方法中,对于每个待定量的肽段,研究人员建立重同位素标记的肽段。他们以不同的量混合这些肽段,并在组织或细胞裂解后立即将一种混合物加入每个生物样品中。研究小组的负责人Forest White认为:“这是关键的一步。你要尽早加入这些肽段,这样重同位素标记肽段和内源肽段的损失可同时发生。”

随后以同位素试剂标记样品,并加入质谱仪中。每个肽段产生两个峰:“重”峰代表合成的(加标)肽段,而“轻”峰代表内源性蛋白。通过定量前者碎片化所产生的标记离子,研究人员能产生每个肽段的标准曲线。之后他们能测定对应内源性肽段的信号,确定样品中存在多少分子。

研究小组利用MARQUIS定量了EGFR信号通路中的酪氨酸磷酸化。在几种配体刺激之后,他们在多个时间点定量了EGFR网络内的磷酸化动力学,实现了EGFR磷酸化位点的定量比较,并证明了对于每种配体,受体磷酸化在性质上相似,但数量上不同。他们还培养了胶质母细胞瘤异种移植物,并应用这种方法定量了EGFR激酶抑制的效果。

“有了这种方法,你就能看到那儿有多少靶点,药物是否命中靶点,以及更重要的是,靶点抑制是否有效阻断了下游的磷酸化,”White说。

据介绍,MARQUIS能同时定量10个样品中多达100种肽段。这只需要一台串联质谱仪(如三重四级杆)、市售的同位素标记试剂,以及重同位素标记的合成肽段。White 认为:“每个人都能实现。我们希望创建出一种相当简单的方法,而不需要什么诀窍。”

原文链接:MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications

 

Absolute quantification of protein expression and posttranslational modifications by mass spectrometry has been challenging due to a variety of factors, including the potentially large dynamic range of phosphorylation response. To address these issues, we have developed MARQUIS—Multiplex Absolute Regressed Quantification with Internal Standards—a novel mass spectrometry-based approach using a combination of isobaric tags and heavy-labelled standard peptides, to construct internal standard curves for peptides derived from key nodes in signal transduction networks. We applied MARQUIS to quantify phosphorylation dynamics within the ​EGFRnetwork at multiple time points following stimulation with several ligands, enabling a quantitative comparison of ​EGFR phosphorylation sites and demonstrating that receptor phosphorylation is qualitatively similar but quantitatively distinct for each ​EGFR ligand tested. MARQUIS was also applied to quantify the effect of ​EGFR kinase inhibition on glioblastoma patient-derived xenografts. MARQUIS is a versatile method, broadly applicable and extendable to multiple mass spectrometric platforms.

 

来源: Nature Communications 浏览次数:229

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