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Nature protocals:荧光原位RNA测序

摘要 : 在生物学中,位置信息是很重要的。mRNA是活跃基因的功能性拷贝,它们在活组织中的定位,往往与细胞和组织的生长发育调控有关。以往人们要磨碎细胞才能同时分析多个mRNA,但这样就无法了解mRNA在细胞中的定位。哈佛医学院Wyss研究所的科学家们解决了这个问题。

在生物学中,位置信息是很重要的。mRNA是活跃基因的功能性拷贝,它们在活组织中的定位,往往与细胞和组织的生长发育调控有关。以往人们要磨碎细胞才能同时分析多个mRNA,但这样就无法了解mRNA在细胞中的定位。

哈佛医学院Wyss研究所的科学家们解决了这个问题。George M Church和Je Hyuk Lee领导团队开发了荧光原位RNA测序(FISSEQ)技术,该技术可以在固定的细胞和组织中,获得全基因组范围的基因表达图谱。

著名遗传学George M. Church是哈佛医学院的遗传学教授、Wyss研究所的核心成员。他被誉为是个人基因组学和合成生物学的先锋。1984年,Church和Walter Gilbert发表了首个直接基因组测序方法,该文章中的一些策略现在仍应用在二代测序技术中。此外,如今的多重化分子技术和条码式标签也是他发明的。Church还是纳米孔测序技术的发明者之一。

FISSEQ最初发表在去年的《科学》(Science)杂志上,研究人员在模拟的创伤修复实验中,全面分析了人类原代成纤维细胞的RNA表达和定位。最近,他们又在Nature Protocols上公布了FISSEQ技术的详细步骤。

RNA测序(RNA-seq)可以在整个转录组中定量评估基因表达发生的改变,但它无法提供基因表达的位置信息。原位杂交能够告诉我们基因表达的位置,但一次只能检测少量基因。与传统方法不同的是,FISSEQ能揭示环境特异性的转录本,保留RNA定位所需的组织结构。

FISSEQ主要是将RNA转化为交联的cDNA扩增子,然后在共聚焦显微镜上进行测序。该技术适用于组织切片和完整的胚胎,不太受光学分辨率的限制,还能减少单分子检测中的噪声信号。这一技术可以实现遗传学元件的大规模平行检测,帮助研究者们分析细胞表型、基因调控和原位环境。

文章指出,文库构建和测序可以在14天内完成,图像分析需要两天时间。有细胞显微操作经验的人都能用上FISSEQ,该技术对计算处理能力的要求很低。

原文链接:Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues

RNA-sequencing (RNA-seq) measures the quantitative change in gene expression over the whole transcriptome, but it lacks spatial context. In contrast, in situ hybridization provides the location of gene expression, but only for a small number of genes. Here we detail a protocol for genome-wide profiling of gene expression in situ in fixed cells and tissues, in which RNA is converted into cross-linked cDNA amplicons and sequenced manually on a confocal microscope. Unlike traditional RNA-seq, our method enriches for context-specific transcripts over housekeeping and/or structural RNA, and it preserves the tissue architecture for RNA localization studies. Our protocol is written for researchers experienced in cell microscopy with minimal computing skills. Library construction and sequencing can be completed within 14 d, with image analysis requiring an additional 2 d.

来源: Nature protocol 浏览次数:82

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